Grootte-uitsluitingschromatografie (SEC - Size Exclusion Chromatography) is een chromatografische scheidingstechniek waarbij moleculen en deeltjes worden gescheiden op basis van grootte. Als stationaire fase worden sepharose korrels gebruikt, dit zijn bolletjes met een diameter tussen 60 en 200 µm.
Deze korrels bevatten poriën waardoor moleculen kunnen doordringen in functie van hun grootte. Kleine moleculen zullen later elueren aangezien zij door meerdere poriën kunnen dringen, in tegenstelling tot de grotere moleculen die niet gemakkelijk door de poriën heen kunnen dringen. In de LECR maken we SEC-kolommen met behulp van 10ml-spuiten met Sepharose CL-2B. Deze worden gebruikt voor EV-isolatie, waarbij EV's worden gescheiden van het grootste deel van de eiwitten in de biologische matrix.
Dichtheidsgradiënt-ultracentrifugatie (UC) wordt gebruikt voor de isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes (EV) uit celkweekmedia en biologische vloeistoffen. Dichtheidsgradiëntscheiding omvat het centrifugeren van een biologisch monster door een centrifugatiemedium met een hogere of gegradeerde dichtheid. Bij blootstelling aan een verhoogde middelpuntvliedende kracht migreren monstercomponenten door het medium en scheiden zich op basis van hun drijfdichtheid. Dit resulteert in de zuivering van EV-populaties door scheiding van verontreinigende eiwit- en / of eiwit-RNA-complexen.
Sucrose is een veelgebruikt medium voor voor dichtheidscentrifugatie, maar heeft een hoge viscositeit en is hypertoon, waardoor het minder ideaal is voor het scheiden van osmotisch gevoelige materialen. Daarom worden bij LECR op iodixanol (OptiprepTM) -gebaseerde gradiënten uitgevoerd, omdat iodixanol in staat iso-osmotische oplossingen te vormen bij alle dichtheden. Als zodanig zal het biologische componenten van het monster niet osmotisch belasten.
Het analyseren van nanodeeltjes-tracking is een techniek die routinematig wordt gebruikt voor de kwantificering en karakterisering van extracellulaire vesikels (EV). Het maakt gebruik van lichtverstrooiing en Brownse bewegingseigenschappen van deeltjes in een monster om de grootteverdeling en concentratie daarvan te berekenen. Een laserstraal wordt door een kamer met zwevende deeltjes geleid en het resulterende verstrooide licht wordt gedetecteerd door een microscoop (x20) met een videocamera erop gemonteerd. Deze camera legt vervolgens videomateriaal vast van de deeltjes die onder Brownse beweging bewegen en de NTA-software volgt vervolgens elk deeltje afzonderlijk en berekent hun hydrodynamische diameter met behulp van de Stokes-Einstein-vergelijking. De deeltjesconcentratie wordt berekend op basis van het aantal gedetecteerde deeltjes per scherm en het totale volume van de kamer. LECR is uitgerust met een LM10 NTA-apparaat voorzien van een 405nm laser voor routinematige lichtverstrooiingsanalyse en een 488nm laser voor de analyse van fluogroen gelabelde deeltjes. Voor dat laatste wordt een 500nm lange doorlaatfilter voor de camera geplaatst en wordt een continu pompsysteem gebruikt om fotoblekende effecten te voorkomen. Verder is het LM10-NTA-toestel voorzien van een 532nm laser.
Biomek-4000 is een geautomatiseerd werkstation: het is een compacte vloeistofbehandelaar die kan helpen bij dagelijkse pipetteerroutines, die werken vanuit enkele flacons of platen met 96 putjes. Het heeft 12 dekposities en kan pipetteren van 1 µL tot 1000 µL. De opzet van het project is volledig aanpasbaar en gemakkelijk te gebruiken, passend bij de behoeften van elk type experiment (monsterverdeling, ELISA's, MTT-testen, celkleuring, ...). De Biomek-4000 in LECR is uitgerust met een positieve druk HEPA-behuizing, die het mogelijk maakt om onder steriele omstandigheden te werken. In LECR wordt de Biomek-4000 vooral gebruikt voor het genereren van iodixanol-dichtheidsgradiënten (zie hierboven), het laden van monsters en het fractioneren van dichtheidsgradiënten om een zuivere en reproduceerbare isolatie van extracellulaire vesikels van allerlei soorten monsters te verzekeren.
